如何建立Flash反相纯化方法？

随着Flash应用的广泛深入，反相C18的纯化分离正变得越来越普遍，与此同时，如何根据分离样品的性质开发出对应的分离方法正变得越来越重要。如果我们借用正相分离方法的思维进行方法开发的话，问题就会变成：我们需要借助反相TLC进行方法开发，这样流程和原理几乎和正相一致，通过TLC得到的数据来进行方法转换。然而反相TLC薄层板有其限制性：

1.由于其是C18基质所构建，使用之前需要进行活化，而当用纯乙腈活化之后，残留的溶剂会和摸索的流动相混合，从而导致最终得到的数据不正确；也可以通过多次润板将相互混合的误差降低到最低，然后如此操作之后会导致巨大的时间浪费，得不偿失。

2.反相C18 TLC板的成本往往很高，商业推广的难度会比较大。

因此目前来说，通过TLC薄层板进行反相Flash方法开发并不是目前主流的方法。

对于反相Flash方法的开发，我们会给您推荐使用HPLC进行方法开发，如果您使用的色谱柱以及其填料和Flash接近，其得到的方法会非常直接和简单。

使用HPLC进行方法开发

在知道为什么我们会要选择HPLC进行方法开发的原因后，接下来我们将为您介绍如何进行实际的方法转换。

简单来说就是在HPLC上尝试到所需要的梯度方法，然后将这个方法（间接）复制到Flash设备上即可，此处之所以我们提到“间接”这个词，是由于HPLC和Flash之间的色谱柱规格以及其填料往往不同，两者的方法之间无法之间复制，需要做一些转换，具体怎么进行转换呢？下面我们用实际的应用案例给大家分享相应的经验。

为了说明他们之间的方法转换所面临的的挑战，我们会用同一个方法在HPLC和Flash进行分离和对比，从而让您看到两者之间的对比。

下表1为HPLC以时间为单位的梯度分离方法，

表 1. HPLC梯度分离方法

下图1 为HPLC图谱分离方法和谱图，可以方法样品得到了很好的分离，其所使用的色谱柱为：Phenomenex Gemini® (4.6 x150 mm, 5 µm)，随后我们将同样的方法转移到Flash上。