Flash纯化时，什么时候需要使用ELSD（蒸发光散射检测器）

Flash快速色谱看似简单，但其实可能很复杂。溶剂选择、色谱柱大小、固定相、载样技术、梯度方法、流速和检测参数都是影响快速色谱和您成功使用该纯化技术的因素。在这些变量中，检测参数(即检测器类型)确确实实会很大程度地影响快速色谱的结果。尽管绝大多数小分子化合物(至少是药物发现实验室制造的化合物)在一个或多个波长上具有紫外线吸收，但随着更多底物的拓展，越来越多的合成和天然化合物几乎没有紫外吸收。当这种情况发生时，大多数化学家会添加不同的检测器，如蒸发光散射检测器(ELSD)，以发现和分离此类样品。然而，根据我的经验，对于许多被认为需要ELSD的化合物，当将DAD二极管阵列UV检测器(全波段扫描)调整到目标产物的适当波长范围时，可以提供足够高的灵敏度，从而保证样品的完整检测;属于这一类别的化合物类型包括一些脂类和萜烯，以及其他具有低紫外线吸收灵敏度的类似化合物。脂质体在最近几年一直在新闻中出现，其是基于mRNA的新冠肺炎疫苗使用几种不同的脂质体化合物而制成，并且是一组通常认为需要非紫外线检测器或ELSD才能有效纯化的化合物。事实上，ELSD检测可以提供预期的结果，但DAD全波长紫外线检测器也可以提供预期的结果，该检测器可以根据这些化合物的具体波长范围(198-810 nm)进行调整。下面我们通过具体的实例来验证波长聚焦检测代替ELSD的合理性，此次我们使用反相快速色谱技术纯化饱和脂肪酸酯-月桂酸甲酯(C12:0)、不饱和脂肪酸酯-油酸甲酯(C18:1)以及胆固醇，以上几种样品都是紫外信号比较弱的样品，是一种用于mRNA疫苗的脂质纳米颗粒混合物的脂质。

 

胆固醇

 

油酸甲酯

 

月桂酸甲酯为了将两种检测方式进行对比，我们此次将波长聚焦的检测技术与ELSD结合使用，该技术使用窄波长范围进行积分加成检测，并在实际上提高了以上这些化合物的紫外吸收强度，其信号强度甚至可以直接媲美ELSD，见图1。

 

图1 紫外波长聚焦检测(198-220 nm)和ELSD通过反相快速色谱纯化 脂质体混合物。尽管通过ELSD(绿色线)每种样品都可以有很好的吸收，但在Selekt紫外聚焦的条件下，月桂酸脂和油酸甲酯的酯基(黑色、红色和蓝色线)都可以被很强的检测到，并且不产生样品损失(和ELSD相比)。另外具有双键的化合物，如油酸甲酯和胆固醇，也会吸收紫外线并可检测，尽管波长很低，如图2所示。

 

图2:每种纯化脂质的紫外光谱。紫外线吸光度范围为200 nm至220 nm。对于此类脂肪类化合物，它们的最佳吸收波长往往在200 nm–220 nm之间，另外这种较窄的紫外吸收范围确实也会影响溶剂的选择，往往此时我们需要选择在该波长范围内没有紫外吸光度的溶剂(乙腈、甲醇、丙酮、己烷、水)。因此此次我们使用水和甲醇进行上述色谱分析。那么，什么时候需要ELSD检测器呢?往往是在纯化那些不含紫外吸收官能团(例如酯)的饱和脂类化合物、饱和萜烯和其他不含紫外吸收基团的分子。但凡您的样品当中一个或者多种脂基羰基这种具有紫外吸收的基团，您都无需额外配置ELSD检测检测，通过Biotage紫外聚焦检测功能即可完成弱紫外吸收样品的分析和检测。文/Biotage